如果說(shuō)明書(shū)中有推薦的稀釋比例,請按照該稀釋比例進(jìn)行實(shí)驗。但是由于標本類(lèi)型、實(shí)驗條件、操作環(huán)境等各種因素的影響,推薦濃度僅作為參考。實(shí)驗者需要在推薦濃度周?chē)M(jìn)行多個(gè)濃度梯度的實(shí)驗,從中發(fā)現zui合適的稀釋比例。
如果說(shuō)明書(shū)沒(méi)有推薦稀釋比例,僅注明“Useatanassaydependentdilution",就需要做大量的預實(shí)驗來(lái)摸索zui合適的比例了。未純化的抗體一般在說(shuō)明書(shū)中不會(huì )標明抗體的濃度,因為大部分全抗血清、培養上清或腹水形式的產(chǎn)品濃度都是沒(méi)有經(jīng)過(guò)測定的。如果未純化抗體產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)中沒(méi)有標明其中特異性抗體的濃度,實(shí)驗者可以參考下表中“估計濃度"確定各種實(shí)驗稀釋比例。
一般來(lái)說(shuō),抗體說(shuō)明書(shū)都會(huì )提供一個(gè)稀釋度范圍,但是,有些公司生產(chǎn)的抗體,其說(shuō)明書(shū)上沒(méi)有提供抗體稀釋度。這是可以理解的,因為如果說(shuō)明書(shū)上標明的抗體稀釋度如果高的話(huà),就說(shuō)明這種抗體效價(jià)不高,質(zhì)量不好。為此,實(shí)驗者可以先在網(wǎng)上搜索一些相關(guān)的文獻,文獻的方法與材料中一般會(huì )把抗體來(lái)源以及稀釋度都詳細的標出的。但真正做實(shí)驗時(shí),還是要根據自己實(shí)驗樣品的情況和檢測指標表達的豐富程度等因素先摸索一下抗體的稀釋度的。
所以在做預實(shí)驗時(shí),就采用倍比稀釋法,先做一個(gè)梯度,比如1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600. 看看在這幾個(gè)梯度范圍內,樣品中的目的蛋白的表達情況,然后再從中確定你認為的稀釋度進(jìn)行正式實(shí)驗,這樣做比較好一些。由于標本類(lèi)型、實(shí)驗條件、操作環(huán)境等各種因素的影響,推薦濃度僅作為參考。
一抗稀釋液一般為PBS/0.4% Triton X-100/1%BSA。