免疫組化實(shí)驗操作注意事項

免疫組化實(shí)驗是一項精密的技術(shù)操作，需要嚴格把控各個(gè)環(huán)節以確保結果的準確性和可靠性。以下是免疫組化實(shí)驗的關(guān)鍵注意事項：



一、血清封閉
血清封閉的目的是為了一抗與組織的非特異性結合，造成假陽(yáng)性，一般會(huì )采用BSA、羊血清等封閉這些位點(diǎn)，封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，室溫封閉10-30min。


二、一抗和二抗濃度和孵育時(shí)間
不同的一抗濃度，孵育時(shí)間和溫度等對染色結果往往有較大的影響。在4℃下，反應緩慢，背景較淺；而37℃反應較快，時(shí)間較短；室溫介于兩者之間，二抗一般室溫孵育30min。


三、DAB顯色
檢測背景的深淺和特異性染色的深淺基本上都以DAB孵育條件決定。DAB的顯色時(shí)間并不是固定的，主要方法是使用顯微鏡控制顯色時(shí)間，到出現特異性染色較強且出現背景著(zhù)色較淺時(shí)就可以沖洗。如果DAB顯色時(shí)間過(guò)長(cháng)（超過(guò)十分鐘）才出現陽(yáng)性染色，可能是一抗體濃度過(guò)低或者封閉時(shí)間過(guò)長(cháng)，也可以加入金屬離子來(lái)增強顯色（如硫酸銅、氯化鈷、硫酸鎳銨等）；如果DAB顯色時(shí)間過(guò)短顏色就很深，這可能是一抗過(guò)高，需要下調抗體濃度，如果短時(shí)間內過(guò)深


四、復染
免疫組化染色后為了襯托出組織形態(tài)結構有必要進(jìn)行復染，常用試劑為Mayer’s蘇木染色，一般為2 min左右，DAB在核蛋白著(zhù)色的時(shí)間可以適當縮短，最后用氨水或PH 8.0的TBS返藍。


五、封片
在封片階段我們通常是用中性樹(shù)膠來(lái)進(jìn)行，封片過(guò)程中注意斜靠蓋玻片防止氣泡的產(chǎn)生從而對結果進(jìn)行營(yíng)影響，建議最好在通風(fēng)櫥操作，這樣有利于氣泡排除干凈，不影響后續的鏡檢。


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