ELISA預實(shí)驗完整攻略

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）預實(shí)驗是開(kāi)展正式實(shí)驗前不可少的環(huán)節，主要用于摸索合適的實(shí)驗條件及確定實(shí)驗的可行性。以下是ELISA預實(shí)驗的開(kāi)展過(guò)程，一起來(lái)看看吧！

 

一、預實(shí)驗的目的

確定實(shí)驗條件：如抗原或抗體的濃度、酶的種類(lèi)和濃度、洗滌液的濃度和pH值等，以確保實(shí)驗的準確性和可靠性。

確定實(shí)驗范圍：包括最佳反應時(shí)間和濃度范圍，以確保在正式實(shí)驗中獲得最佳的實(shí)驗結果。

驗證實(shí)驗方法：確保實(shí)驗方法的準確性和可靠性。

減少實(shí)驗誤差：提高實(shí)驗的重復性和可重復性。

 

二、預實(shí)驗的方法

 

1.實(shí)驗樣本的選擇：

預實(shí)驗一般通過(guò)測定少數有代表性的樣本來(lái)確定正式實(shí)驗方案。通常，測定的樣本會(huì )分為不同的組別，不同組別的樣本由于前期處理或刺激后，靶標物的表達量會(huì )產(chǎn)生變化。建議從各組樣本中隨機選擇1~2例樣本。如果正式實(shí)驗測定的樣本數量多，分配到預實(shí)驗的試劑量有限，那么至少選擇兩例樣品，建議選用1例為理論上靶標物含量zui低組的樣品，另1例為理論上靶標物含量最高組的樣品。

 

2.最適稀釋倍數的確定：

①將樣本梯度稀釋?zhuān)筛鶕颖局邪袠宋锏臐舛?，選擇2倍、5倍或10倍梯度稀釋?zhuān)瑫r(shí)測定標準品。

②標準品的制備需按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求，試劑量充足可以選擇一條完整的標曲，試劑量有限也可以選擇部分濃度點(diǎn)（如空白孔、zui低濃度孔、中間濃度孔以及最高濃度孔）。

③將測定的不同稀釋濃度的樣本測定的OD值（光密度值）與梯度濃度標準品OD值進(jìn)行對比，最佳稀釋倍數為此倍數稀釋后全部或絕大多數樣本OD值能夠位于標準曲線(xiàn)中間濃度孔對應的OD值，即標準曲線(xiàn)的最佳擬合區域。

④在做預實(shí)驗時(shí)，一定要設置標曲，不設置標曲則無(wú)法通過(guò)比較確定最適稀釋倍數。

 

3.抗原包被濃度的設定：

①將抗原溶液分別按照1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的濃度稀釋在抗原包被液中。

②以等量隨機選取的特異性抗體血清與抗原溶液反應，在37℃孵育1小時(shí)后清洗，然后加酶標二抗，孵育30分鐘清洗，zui hou加底物顯色，反應終止后用酶標儀在450nm波長(cháng)下測定各孔的光密度值。

③繪制ROC曲線(xiàn)（受試者工作特征曲線(xiàn)），找出臨界值。

 

4.酶標二抗稀釋比例的確定：

①取已知陽(yáng)性和陰性血清樣本，分別用ELISA稀釋液將特異性抗體稀釋成不同濃度的酶標二抗溶液，與包被抗原孵育、清洗后加底物顯色，zui hou用酶標儀測定光密度值。

②繪制ROC曲線(xiàn)，找出臨界值。

 

5.顯色時(shí)間的確定：

①顯色是ELISA實(shí)驗中zui hou一步溫育反應，固定在酶標板上的酶催化無(wú)色底物生成有色產(chǎn)物。

②由于ELISA實(shí)驗會(huì )受到環(huán)境差異及實(shí)驗操作差異的影響，商業(yè)化的ELISA試劑盒通常不會(huì )推薦固定的顯色時(shí)間，而是建議實(shí)驗操作人員根據顯色情況判斷合適的顯色反應時(shí)間。

③加入底物后可定時(shí)觀(guān)察反應孔的顏色變化（如每隔5分鐘觀(guān)察一次），當標準孔的前3~4孔有明顯的梯度藍色，后3~4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止。通過(guò)預實(shí)驗熟悉操作的同時(shí)，也能確定合適的顯色時(shí)間。

 

三、注意事項

①在進(jìn)行預實(shí)驗時(shí)，應嚴格按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，避免由于操作不當導致的實(shí)驗誤差。

②預實(shí)驗的結果應認真記錄和分析，以便為正式實(shí)驗提供可靠的依據。

③在預實(shí)驗過(guò)程中，如發(fā)現任何異?；虿环项A期的結果，應及時(shí)查找原因并進(jìn)行調整。

 

通過(guò)以上預實(shí)驗的設置和操作，可以對ELISA實(shí)驗的條件進(jìn)行初步的摸索和優(yōu)化，為后續的正式實(shí)驗提供可靠的基礎。同時(shí)，也能及時(shí)發(fā)現實(shí)驗中存在的問(wèn)題，進(jìn)行針對性的改進(jìn)，提高實(shí)驗的準確性和可靠性。上海恒遠生物專(zhuān)業(yè)提供生命科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)服務(wù)，提供實(shí)驗技術(shù)服務(wù)，為廣大科研工作者大大節省了重復勞動(dòng)的時(shí)間和精力，我們有過(guò)硬的技術(shù)咨詢(xún)和完善的售后服務(wù)，購買(mǎi)ELISA試劑盒贈送免費代測服務(wù)，在線(xiàn)一對一技術(shù)指導，為您解決后顧之憂(yōu)。