FCM是利用流式細胞儀對處在快速直線(xiàn)流動(dòng)狀態(tài)中的單列細胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數、快速的定性、定量分析或分析技術(shù)。然而，在FCM的實(shí)際應用過(guò)程中，要想得到高質(zhì)量的流式數據卻并非易事?，F就FCM實(shí)驗中的常見(jiàn)問(wèn)題進(jìn)行分析，希望能幫助相關(guān)實(shí)驗人員提高實(shí)驗成功率。
一、怎么選擇合適的對照？
1）同型對照：使用同型抗體做平行實(shí)驗，主要目的是消除抗體與樣本的非特異性結合。
2）陰性細胞對照：使用已知的不表達目標抗原的細胞做平行實(shí)驗，主要目的是消除抗體的非特異性結合。
3）二抗對照：第二抗體多為熒光標記的多抗，非特異性結合一般較高，可能造成基礎熒光值偏高，設立二抗對照平行實(shí)驗的主要目的是消除二抗的非特異性熒光著(zhù)色。
4）陽(yáng)性對照：一般會(huì )使用已知的高表達目標抗原的細胞做平行實(shí)驗，主要目的是排除實(shí)驗中實(shí)驗方法、試劑、操作等實(shí)驗的影響因素。
5）空白對照：不進(jìn)行任何標記的細胞，主要目的是用于測定基礎熒光信號表達值。
二、收集的細胞通過(guò)流式儀檢測時(shí)，一般多少的細胞量合適？
進(jìn)行流式檢測時(shí)，至少需要記錄5000個(gè)活細胞，一般調整細胞密度至1*106/100ul進(jìn)行流式檢測。
三、FCM檢測過(guò)程中如何設門(mén)（gating）？
一般根據散射光進(jìn)行設門(mén)，即我們通常所說(shuō)的前散（forward scatter, FSC）和側散（side scatter, SSC）來(lái)設門(mén)。FSC的大小與細胞的直徑成正相關(guān)，不同的細胞，細胞越大，其FSC越大；反之越小。SSC的大小與細胞內顆粒結構的質(zhì)量成正相關(guān)，不同的細胞，細胞內顆粒結構越復雜，質(zhì)量越大，其SSC越大；反之越小。
四、FCM檢測過(guò)程中如何調節補償？
在FCM檢測過(guò)程中，如果存在多色，則必須進(jìn)行熒光補償調節。調節補償首先要知道雙陰性細胞的情況，其次，必須要用單陽(yáng)和雙陰性細胞。只有在有陰性細胞作為參照的情況下，才能既不會(huì )過(guò)多又不會(huì )過(guò)少地調節補償。
五、FCM檢測時(shí)，每次實(shí)驗的細胞數一定要相同嗎？
FCM檢測時(shí)，若不進(jìn)行細胞計數而憑感覺(jué)隨意進(jìn)行實(shí)驗會(huì )直接影響實(shí)驗結果。當細胞量多而抗體量不變或細胞量不變而抗體量減少，那么熒光抗體平均分布到每個(gè)陽(yáng)性細胞上的量就會(huì )相對減少。由此可見(jiàn)，不同的細胞量會(huì )影響最終的實(shí)驗結果。因此，在準備樣本時(shí)，必須進(jìn)行細胞計數，使每個(gè)分組及每次實(shí)驗的細胞數保持一致。
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