ELISA實(shí)驗中,常見(jiàn)的背景偏高,靈敏度偏低問(wèn)題,造成的原因有很多,我司技術(shù)人員就此給大家總結歸納如下:
背景偏高問(wèn)題
原因一:孔洗滌不充分
解決方案:按照實(shí)驗方案建議進(jìn)行洗滌。
原因二:洗滌緩沖液污染
解決方案:制備新鮮的洗滌緩沖液。
原因三:檢測試劑過(guò)多
解決方案:確保試劑被正確稀釋或者減少檢測試劑的推薦濃度。
原因四:封閉緩沖液無(wú)效(例如檢測試劑結合封閉劑;孔未*封閉)
解決方案:嘗試不同的封閉劑和/或將封閉劑添加到洗滌緩沖液。
原因五:孵育/洗滌緩沖液的鹽濃度
解決方案:增加鹽濃度可能會(huì )降低非特異性和/或減弱脫靶相互作用。
原因六:讀板前加入終止液后時(shí)間太長(cháng)
解決方案:添加終止液后立即讀板。
原因七:抗體出現非特異性結合
解決方案:使用適當的封閉緩沖液,例如 BSA 或 5-10% 正常血清,如果是直標一抗,使用與一抗種屬相同的血清,如果是非直標一抗,則使用與二抗種屬相同的血清。確??滓呀?jīng)過(guò)預處理,以防止非特異性附著(zhù)。
原因八:高抗體濃度
解決方案:嘗試不同的稀釋度,以獲得*結果。
原因九:底物孵育在光下進(jìn)行
解決方案:底物孵育應避光進(jìn)行,或根據試劑的實(shí)驗方案建議進(jìn)行。
底物加入后孔中有沉淀生成
解決方案:增大樣品的稀釋倍數或降低底物濃度。
孔板臟
解決方案:清潔孔板底部。
靈敏度偏低問(wèn)題
原因一:ELISA試劑盒保存不當
解決方案:按推薦方式保存所有試劑。請注意,各試劑的保存條件可能有所不同。
原因二:靶標不足
解決方案:濃縮樣品或降低樣品稀釋度。
原因三:檢測試劑失活
解決方案:確保報告酶/熒光素具有預期的活性。
原因四:酶標儀設置不正確
解決方案:在檢測中,確保酶標儀設置為正確的吸收波長(cháng)或激發(fā)/發(fā)射波長(cháng)。
原因五:測定方法不夠靈敏
解決方案:更換更靈敏的檢測系統(例如從比色檢測轉變?yōu)榛瘜W(xué)發(fā)光/熒光檢測)。更換更靈敏的測定方法(例如從直接 ELISA 方法轉變?yōu)閵A心 ELISA 方法)。延長(cháng)孵育時(shí)間或升高溫度。
原因六:微量滴定板吸附靶標的效果不佳
解決方案:將靶標共價(jià)結合到微量滴定板。
原因七:底物不足
解決方案:加入更多底物。
原因八:樣品類(lèi)型不兼容(例如血清與細胞提取物)
解決方案:對于沒(méi)有驗證過(guò)的樣品種屬,檢測信號可能減弱或沒(méi)有。使用驗證過(guò)的樣品類(lèi)型作為陽(yáng)性對照同時(shí)進(jìn)行檢測。
原因九:緩沖液或樣品成分干擾
解決方案:確認試劑中是否存在干擾性化合物。例如,抗體中的(die)(dan)hua鈉會(huì )抑制 HRP 酶,在血漿中用作抗凝劑的 EDTA 會(huì )抑制酶反應。
原因十:混合或混用不同試劑盒的試劑
解決方案:避免混合來(lái)自不同試劑盒的試劑。